Reverse Direction Method: A Possible Tool to Link Animal Models with Corresponding Human Diseases and Disorders / Метод "Reverse Direction": потенциальный инструмент для ассоциации животных моделей с соответствующими человеческими заболеваниями и расстройствами: Genome Wide Screenings of the Inflammation Amplifier

~~

platon_work 19.03.14 в 16:34

Так как усилитель воспаления является крайне необходимым молекулярным механизмом на моделях животных, мы выдвинули гипотезу, что его непрерывная активация ответственна за хроническое воспаления не только у животных, но в той же степени и у людей.

platon_work 19.03.14 в 18:38

Другими словами, места активации усилителя воспаления определяют места развития широкого диапазона хронических воспалительных заболеваний и расстройств, включая аутоиммунные заболевания, метаболические синдромы, нейродегенеративные заболевания и другие воспалительные заболевания человека.

platon_work 19.03.14 в 19:10

~

platon_work 19.03.14 в 19:11

Библиотеки лентивирусов, имеющих малые РНК, образующие шпильки (sh-RNA), обеспечивают действенный подход, позволяющий сделать мишенью все гены в мышиных или человеческих клетках.

platon_work 19.03.14 в 19:31

Есть, по крайней мере, несколько преимуществ использования библиотек shRNA над использованием siRNA библиотек, включая эффект долговременности, удобство в использовании клеток, мутантных по определённому гену, и упрощение применения в исследованиях in vivo.

platon_work 19.03.14 в 23:18

Важно, что лентивирусные векторы поражают неделящиеся клетки, что означает то, что они могут быть использованы для эффективного подавления генной экспрессии in vivo.

platon_work 20.03.14 в 09:25

Кроме того, когда библиотеки лентивирусных shRNA комбинированы с большим количеством cell-based проб, то они обеспечивают уникальную возможность для высокопроизводительного обнаружения генов, отвечающих за сложные клеточные фенотипы in vitro.

platon_work 20.03.14 в 10:38

Мы недавно применили эти методы, чтобы понять молекулярный механизм, который активирует усилителя воспаления.

platon_work 20.03.14 в 10:44

~

platon_work 20.03.14 в 10:45

Рисунок 1: Усилитель воспаления.

platon_work 20.03.14 в 10:45

A) IL-17 и IL-6 функционируют вместе, чтобы индуцировать образование избыточных хемокинов и IL-6 на неимунных клетках, таких как эндотелиоциты и фибробласты.

platon_work 20.03.14 в 18:59

B) IL-17 из Th17-клеток, который с годами возрастает, индуцировал образование IL-6 из неиммунных клеток, изначально имевшего низкую концентрацию, за счёт активации NFκB в начальной фазе аутоиммунных заболеваний.

platon_work 20.03.14 в 19:25

Небольшое количество IL-6 вместе с IL-17 синергически активируют усилитель воспаления посредством активации транскрипционных факторов NFκB и STAT3.

platon_work 20.03.14 в 19:36

Впоследствии усилитель воспаления индуцирует выработку чрезмерного количества многих провоспалительных цитокинов, включая IL-7 и хемокины, что, в конечном счёте, ведёт к локальному накоплению различных иммунных клеток, за которым следует дисрегуляция местного гомеостаза и инициируется воспаление.

platon_work 20.03.14 в 20:09

Постоянная активация усилителя воспаления является главным патогенетическим механизмом для мышиных моделей ревматоидного артрита и рассеянного склероза.

platon_work 20.03.14 в 20:18

~

platon_work 20.03.14 в 20:11

Мы произвели систематические скрининги, используя библиотеку shRNA, которая содержит около 65500 лентивирусов, имеющих shRNA и покрывает около 16000 мышиных генов.

platon_work 20.03.14 в 22:22

Каждый лентивирус был внедрён в мышиную эндотелиальную клеточную линию -- BC1 -- в присутствии IL-17 и hIL-6, которые являются стимуляторами, соответственно, NFkB и STAT3, и обнаружен с помощью измерения IL-6, который является маркером для усилителя воспаления и клеточной жизнеспособности.

platon_work 20.03.14 в 23:10

В совокупности, 1289 генов были идентифицированы как позитивно-регуляторные кандидаты активации усилителя воспаления.

platon_work 20.03.14 в 23:36

С тех пор как мы применили строгий критерий скрининга (который содержит значимые пороги для клеточной жизнеспособности, а также уровень подавления анализируемых цитокинов одним или более клонами shRNA), частота ложно-позитивных результатов нашего основанного на shRNA скрининга была низкой (<30%).

platon_work 21.03.14 в 11:19

Таким образом, разумно предположить, что, по крайней мере, 70% кандидатных генов (около 900 генов) из функционального shRNA-скрининга участвуют в активации усилителя воспаления.

platon_work 24.03.14 в 13:11

Наряду с этим скринингом, мы также произвели анализ ДНК мышиных и человеческих фибробластов на микрочипах в присутствии IL-17 и hIL-6, чтобы идентифицировать гены-мишени усилителя воспаления, найдя 576 мышиных и 885 человеческих генов-мишеней.

platon_work 24.03.14 в 14:28

Несмотря на то, что мы идентифицировали различные гены, сцепленные с патологическими процессами типа усилителя воспаления с помощью животных моделей, пока ещё возможно, что геномные ответы у этих моделей могут не соответствовать патогенезу у людей.

platon_work 24.03.14 в 14:56

Следовательно, мы разработали метод, который может напрямую связать результаты на животных моделях с человеческими случаями.

platon_work 24.03.14 в 15:03

~

platon_work 24.03.14 в 15:03

Рисунок 2: Схематическое изображение метода "reverse-direction" для усилителя воспаления.

platon_work 24.03.14 в 16:19

~

platon_work 24.03.14 в 16:19

На шаге 1 полногеномные скрининги были произведены посредством РНК-интерференции с использованием библиотеки shRNA лентивирусов мышей и посредством экспериментов на ДНК-микрочипах с использованием чипов мышиной ДНК, чтобы идентифицировать гены, ассоциированные с активацией усилителя воспаления.

platon_work 24.03.14 в 16:37

В целом, было идентифицировано 1289 позитивных регуляторов, 576 мышиных и 885 человеческих генов-мишеней.

platon_work 24.03.14 в 16:48

На шаге 2 база данных полногеномных исследований генетических ассоциаций была использована для того, чтобы связать результаты скрининга с человеческими заболеваниями и расстройствами.

platon_work 24.03.14 в 18:52

Для многих генов из данных полногеномного скрининга показаны значительные ассоциации с различными человеческими заболеваниями и расстройствами кроме психических заболеваний.

platon_work 24.03.14 в 19:16

На шаге 3 проверка метода "reverse direction" была осуществлена при помощи механизма эпирегулин (Ereg)-ErbB1.

platon_work 24.03.14 в 19:35

Ereg-ErbB1-путь активирует усилитель воспаления с помощью повышения активности NFκB через PI3Kα-AKT.

platon_work 24.03.14 в 19:42

Поскольку Ereg был идентифицирован в качестве гена-мишени усилителя воспаления, то там должна быть петля положительной обратной связи Ereg-ErbB1 (правый круг).

platon_work 24.03.14 в 20:01

Наконец, сывороточные концентрации Ereg были повышены у пациентов, страдающих ревматоидным артритом, рассеянным склерозом или атеросклерозом.

platon_work 24.03.14 в 20:13

~~

platon_work 24.03.14 в 20:13